一、研究背景

角膜必須保持透明，以確保視力清晰。角膜由五層組成：三層充滿細胞，兩層主要由蛋白質(zhì)構(gòu)成。角膜內(nèi)皮層是角膜的最內(nèi)層，由單層角膜內(nèi)皮細胞（CEC）組成，細胞密度很高。它固定在厚度約為 10 微米的德斯梅特膜（DM）上。人類的 CECs 本身無法在體內(nèi)增殖，因此在細胞丟失的情況下無法再生。CECs 的首要作用是從前房輸送營養(yǎng)物質(zhì)，同時維持精確的水合水平，從而保持角膜的厚度和透明度。這一功能的中斷會導(dǎo)致角膜造口和表面上皮水腫。鑒于全球角膜捐獻的稀缺性，目前仍迫切需要開發(fā)培養(yǎng) CEC 移植方法。目前移植 CECs 的方法包括直接注射和在制作好的載體上移植薄片，模仿 DMEK 移植手術(shù)。直接注射細胞的優(yōu)點是不需要額外材料，可最大限度地減少免疫反應(yīng)。雖然細胞直接注射法在臨床試驗中顯示出良好的效果，但目前尚未獲得美國食品及藥物管理局的批準，也未廣泛用于患者。目前仍然需要開發(fā)移植方法，以克服全球移植組織嚴重短缺的問題。要做到這一點，就必須創(chuàng)造一種免疫原性極低的瞬時載體，將細胞輸送到角膜內(nèi)部。用于這一目的的材料應(yīng)薄而柔韌，便于在手術(shù)過程中滾動和折疊，多孔，便于滲透，具有適合手術(shù)操作的機械性能，并且透明。

利用靜電紡絲設(shè)備電紡絲是制造高滲透性薄膜的最有價值的工具之一。它能夠制造各種形式的納米纖維支架，并已被積極應(yīng)用于組織工程領(lǐng)域，特別是傷口愈合、血管移植和心臟組織工程。在 DMEK 角膜移植手術(shù)中，先將 7 至 8 毫米的德斯密特膜圓盤和附著的內(nèi)皮細胞卷成圓筒狀，然后通過 2.4 至 4.0 毫米的切口注入前房。然后展開移植移植片，將內(nèi)皮朝下妥善放置，再借助氣泡粘附到后角膜上。目前，角膜外科醫(yī)生成功采用了 DMEK 技術(shù)，內(nèi)皮細胞損失極少。要在培養(yǎng)的 CECs 上復(fù)制這一過程，工程膜必須正確模擬 Descemet 膜。主要使用高生物相容性天然聚合物開發(fā)的載體往往會在細胞培養(yǎng)過程中失去機械特性，因此不適合移植。

在本研究中，我們旨在通過將明膠溶液電紡成納米纖維膜，開發(fā)一種用于 CEC 移植的載體。明膠源自膠原蛋白，利用其顯著的生物相容性，已被應(yīng)用于傷口愈合和骨再生等多個領(lǐng)域。此外，明膠還具有有利于電紡絲的特性，如在非有機溶劑中的高溶解性。這種特性不僅能減輕毒性，還能在制備電紡絲溶液時方便地改變?nèi)軇?。我們的目標是通過減少其他合成聚合物和有機溶劑的使用，最大限度地降低毒性和免疫反應(yīng)。gelNF 膜已在多個領(lǐng)域得到應(yīng)用，但為了獲得更強的性能，它們通常與各種合成聚合物混合使用。為了解決與使用有機溶劑相關(guān)的透明度和毒性問題，我們試圖探索電紡凝膠納米纖維膜作為 CEC 移植載體的潛在用途。通過將人類和兔子的 CEC 移植到制造好的凝膠 NF 膜上確認蛋白質(zhì)表達后，我們進行了體外測試，以驗證將細胞移植到新鮮采集的兔子角膜上的效果。

二、摘要

角膜內(nèi)皮由密集的角膜內(nèi)皮細胞（CEC）組成，附著在德斯梅特膜（DM）上，通過調(diào)節(jié)水和離子的流動，在維持角膜透明度方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。角膜內(nèi)皮細胞在體內(nèi)的再生能力有限，而且全球缺乏供體角膜來替代受損的角膜內(nèi)皮細胞。開發(fā)一種培養(yǎng) CECs 的載體可以滿足這一全球性的臨床需求。在這項研究中，我們利用電紡絲設(shè)備成功制造了明膠納米纖維膜（gelNF 膜），然后用戊二醛（GA）進行交聯(lián)。與玻璃相比，制造出的凝膠納米纖維膜的透明度約為 80%，厚度保持在 20 微米。對于 Descemet 膜類似物來說，凝膠NF 膜具有理想的滲透性和降解性。重要的是，在凝膠無紡布膜上高密度培養(yǎng)的 CECs 沒有顯示出細胞毒性效應(yīng)，而且關(guān)鍵的 CEC 功能生物標志物的表達也得到了驗證。為了評估這種凝膠NF膜作為培養(yǎng)的CEC移植載體的潛力，我們用它在兔子眼睛上進行了戴斯麥膜內(nèi)皮角膜移植術(shù)（DMEK）。結(jié)果表明，這種凝膠NF膜有望成為培養(yǎng)CEC移植的合適載體，它在透明度、滲透性和成功移植所需的足夠機械性能方面都具有優(yōu)勢。

三、結(jié)論

本研究的目的是開發(fā)一種用于移植培養(yǎng)的 CECs 的材料。我們利用電紡絲技術(shù)開發(fā)了一種凝膠無紡布膜，它能保持足夠的厚度、透明度和通透性，以保證角膜的正常功能。我們還證實，在凝膠無紡布膜上生長的 CECs 能表達 ZO-1 等功能性生物標記物。此外，通過體外研究，我們還驗證了在凝膠無紡布膜上培養(yǎng)的角膜營養(yǎng)細胞具有適合移植的特性，并能成功粘附在角膜上。因此，gelNF 膜具有作為培養(yǎng) CEC 移植材料的潛力。

圖1.根據(jù)凝膠納米纖維膜的厚度和透明度優(yōu)化紡絲時間和交聯(lián)時間。(A) 不同紡絲和交聯(lián)時間下凝膠納米纖維膜的宏觀圖像。圖像右上角的數(shù)字表示斜線左邊的紡絲時間和斜線右邊的交聯(lián)時間。右上角的數(shù)字表示旋轉(zhuǎn)時間/GA 交聯(lián)時間。(B) 不同紡絲時間和交聯(lián)時間下凝膠納米纖維膜的透明度測量值與波長的函數(shù)關(guān)系。

圖2.凝膠納米纖維膜的納米纖維直徑和機械性能分析。(A) GA 交聯(lián)前后凝膠納米纖維膜的掃描電鏡圖像和 (B) 納米纖維直徑的計算結(jié)果。(C) gelNF 膜的拉伸應(yīng)力測試及彈性模量、斷裂伸長率和極限拉伸強度的計算結(jié)果。ns = 無顯著差異，**** = 有顯著差異。

圖3.凝膠NF 膜的滲透性和降解性。(A) 使用 FITC-葡聚糖和細胞插入物對凝膠NF 膜進行滲透性測試。(B) 測量凝膠NF 膜的滲透性隨培養(yǎng)時間的變化。第 0 天刻度線： 第 0 天刻度線：40 微米，第 14 天刻度線：10 微米： 10 微米。(C) 利用厚度變化測量凝膠NF 膜的降解情況。** = 顯著差異。