一、研究背景

在天然宏觀材料中，蛛絲是具有優(yōu)良生物相容性和機(jī)械性能的主要材料之一。早在古希臘時(shí)期，就有人們利用蜘蛛絲止血和愈合傷口的記載。由于蜘蛛絲具有細(xì)胞粘附性能，已被應(yīng)用于促進(jìn)體外細(xì)胞培養(yǎng)的活力和存活率。由于蜘蛛絲是由蜘蛛絲蛋白（spidroin）組成，其潛在的功能化蛋白質(zhì)基因使其在細(xì)胞特異性粘附方面具有天然優(yōu)勢(shì)。同時(shí)，蜘蛛絲具有良好的水蒸氣滲透性，使其更接近天然皮膚組織，為細(xì)胞提供更仿生的生理環(huán)境，從而有利于誘導(dǎo)組織再生。在蛋白質(zhì)成型的眾多方法中，纖維是最受關(guān)注的技術(shù)之一。 基于電紡絲的生物分子纖維可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞定向遷移和修復(fù)，促進(jìn)傷口愈合，因此利用靜電紡絲設(shè)備是制備蜘蛛絲纖維的有效手段。然而，由于蜘蛛的特殊性，很難大規(guī)模獲得天然蛛絲，許多人致力于制造人工蛛絲，主要是通過異源表達(dá)重組蛛絲蛋白，然后在人工紡絲裝置中紡絲。然而，天然蜘蛛絲基因的高 GC 含量、重復(fù)核心區(qū)的高重復(fù)氨基酸序列、高特異性氨基酸含量和高分子量對(duì)其高效異源表達(dá)構(gòu)成了巨大挑戰(zhàn)，這限制了蜘蛛絲的廣泛應(yīng)用，也限制了基于電紡絲技術(shù)制備重組蜘蛛絲的能力。因此，迫切需要更有效地異源表達(dá)主要安普拉蛛絲蛋白（MaSp）的策略。

過去二十年來，人們開發(fā)了許多策略來提高 MaSp 的異源表達(dá)效率。其中一種方法是設(shè)計(jì)一種由端部結(jié)構(gòu)域和中央重復(fù)區(qū)域組成的迷你螺線管蛋白，與天然螺線管蛋白模板相比，該模板大大縮短。值得注意的是，在低濃度下（至少需要 50% w/v 才能成絲），迷你蜘蛛蛋白的成絲能力明顯降低，這間接降低了其高產(chǎn)量的吸引力。為了提高成絲能力，用淀粉樣多肽取代了 MaSp 中心重復(fù)區(qū)的丙氨酸基團(tuán)，并增加了 MaSp 中心重復(fù)區(qū)的數(shù)量，從而獲得了超高分子量的重組蜘蛛蛋白。然后用有機(jī)溶劑對(duì)獲得的不溶性聚集體進(jìn)行溶解和紡絲。這種方法可以將表達(dá)的大蜘蛛蛋白紡成具有高拉伸強(qiáng)度的纖維，但蛋白產(chǎn)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到工業(yè)化生產(chǎn)的要求。通過適當(dāng)增加迷你蜘蛛蛋白所需的氨基肽置換中心重復(fù)區(qū)的數(shù)量，可以在成絲性能和異源表達(dá)效率之間取得相對(duì)平衡，實(shí)現(xiàn)高性能重組蜘蛛蛋白的批量生產(chǎn)。

二、摘要

蜘蛛絲蛋白（spidroin）獨(dú)特的三維結(jié)構(gòu)決定了spidroin纖維優(yōu)異的機(jī)械性能，但重組蜘蛛絲蛋白異源表達(dá)困難、紡絲性能差等問題限制了其應(yīng)用。通過序列修飾獲得了一種高產(chǎn)低分子量的仿生物蜘蛛絲蛋白（Amy-6rep），并利用靜電紡絲設(shè)備將其用作納米發(fā)電機(jī)驗(yàn)證了其優(yōu)異的紡絲性能。Amy-6rep 增加了天然 spidroin 核心重復(fù)區(qū)中高度纖維化的微晶區(qū)，序列長度有限，并通過結(jié)構(gòu)相似性用淀粉樣多肽取代了多聚丙氨酸序列。由于序列的修飾，Amy-6rep 的表達(dá)量增加了≈200%，Amy-6rep 的自組裝性能也顯著提高。用Amy-6rep進(jìn)行電紡絲后，納米纖維表現(xiàn)出良好的摩擦發(fā)電能力。本文報(bào)告了一種具有高產(chǎn)率和良好紡絲性能的仿生物紡絲素序列設(shè)計(jì)，并探討了電紡絲生產(chǎn)人工納米發(fā)電機(jī)的策略。

三、結(jié)論

在此，我們根據(jù)β折疊晶體結(jié)構(gòu)的相似性，將低分子量螺旋藻素策略與淀粉樣多肽置換的序列修飾策略相結(jié)合，提出了理想的微晶區(qū)數(shù)量，將天然螺旋藻素核心重復(fù)區(qū)的高纖維化微晶區(qū)數(shù)量增加到6個(gè)，并限制了序列長度。最后，通過構(gòu)建大腸桿菌異源表達(dá)載體，獲得了產(chǎn)量高、分子量低的仿生螺旋藻素。由于仿生蜘蛛蛋白中淀粉樣多肽的序列重復(fù)率低，仿生蜘蛛蛋白Amy-6rep的異源表達(dá)產(chǎn)率提高了≈200%，為后續(xù)的大規(guī)模紡絲奠定了基礎(chǔ)。事實(shí)證明，合理增加微晶區(qū)的數(shù)量可以提高仿生螺旋藻蛋白的自組裝性能，但對(duì)異源表達(dá)水平?jīng)]有顯著影響。值得注意的是，我們對(duì)以沉淀形式表達(dá)的仿生蜘蛛蛋白采用了一種簡單的包涵體洗滌方法，結(jié)果表明這種純化方法的回收率達(dá)到了≈80%，與之前的Ni-NTA純化方法相比，回收效率顯著提高，間接提高了仿生蜘蛛蛋白的產(chǎn)量。

圖1.以低分子量生物仿生蜘蛛蛋白電紡絲為原料，生物合成并生產(chǎn)納米級(jí)生物仿生蜘蛛絲。由于序列長度有限，天然蜘蛛絲蛋白 MaSp1 的聚丙氨酸（polyAla）結(jié)構(gòu)被縮短，并增加了微晶區(qū)的數(shù)量，以降低異源表達(dá)的難度。在此基礎(chǔ)上，用具有交叉β-棘結(jié)構(gòu)的淀粉樣多肽序列取代了多丙氨酸特征基序，進(jìn)一步降低了表達(dá)難度，并提高了所得蛋白質(zhì)的機(jī)械性能。從工程菌中生物合成了仿生蜘蛛絲，并將其純化為紡絲膏。通過高壓電紡絲獲得了具有三發(fā)電性能的仿生納米蜘蛛絲，并利用這一特性制備了納米發(fā)電機(jī)。

 

圖2.a) 擬生物刺桐素的固體粉末。 i) 擬生物刺桐素在不同溶液中的溶解狀態(tài)。從左到右依次為：1 毫克仿生物刺鏈蛋白溶于 1 毫升純水；100 毫克仿生物刺鏈蛋白溶于 500 微升 HFIP；1 毫克背景大腸桿菌蛋白溶于 1 毫升 HFIP (ii)。b) 通過電紡絲獲得的納米磷脂纖維的掃描電鏡圖像（iii）和（iv）。 c) 納米磷脂纖維膜的物理圖像（v）；納米磷脂纖維摩擦發(fā)電示意圖（vi）和（vii）。示波器記錄摩擦納米磷纖維膜產(chǎn)生的電動(dòng)勢(shì)（viii）。在緩慢和快速的手部摩擦下，納米空間纖維為一個(gè) 50 nF 的電容器充電（ix）。納米石墨烯纖維摩擦產(chǎn)生的電能點(diǎn)亮 LED 燈（x）。比例尺： 5 毫米 (i)、20 微米 (iii)、2 微米 (iv)、1 厘米 (v)、2 厘米 (viii)。